Анализ крови на ПЦР – лабораторный анализ, помогающий выявить наличие бактериальных и вирусных возбудителей.
Результаты ПЦР диагностики
Для получения максимально достоверных результатов важен правильный забор биологического материала. Он должен исключать загрязнение инородными инфекционными агентами. ПЦР положительный чаще всего фиксируется в период клинических симптомов разгара болезни. В случае носительства возбудителя, а также до трех-шести месяцев после проведения лечения и эрадикации возбудителя. Нередко встречается и ложноположительные результаты ПЦР сразу после лечения.
Когда разрушенные участки генетического материала уже погибшего возбудителя еще сохраняются в крови или биологических средах. Результат становится отрицательным по истечении шести-девяти месяцев после терапии. Какой врач проводит расшифровку ПЦР-исследований Первично назначается анализ либо венерологом, либо урологом, либо гинекологом для женщин. Оценка анализа и выставление результатов в бланке ответа — это функция врача-лаборанта, проводившего исследование.
Дальнейшая интерпретация полученных данных — это функционал узкого специалиста, к которому обращается пациент.
Видео 1. Однажды он рассказал о ночной встрече со светящимся зеленым енотом в лесу рядом со своим загородным домом.
В 1998 году вышла книга Кэри Мюллиса «Танец обнаженного разума» Dancing naked in the mind field , где в обрамлении автобиографических историй ученый высказывает своё мнение о глобальном потеплении, СПИДе и других волнующих общество вопросах. Мюллис верит в астрологию и считает, что значительного изменения климата не происходит, между ВИЧ и СПИДом нет никакой связи, а все исследования, говорящие об обратном, — плоды заговора ученых-карьеристов с правительствами их стран. Компания Cetus подала патентную заявку на метод ПЦР с Taq-полимеразой, и ее одобрили в октябре 1990 года.
Журнал Science объявил Taq-полимеразу молекулой года, а статья сотрудников Cetus о ПЦР с ее использованием [15] несколько лет поддерживала статус самой цитируемой биологической публикации [16]. В августе химический гигант DuPont подал против Cetus иск, в котором утверждал, что патенты на ПЦР получены неправомерно, поскольку этот процесс еще в 1970-х описал Хьелль Клеппе. Но через год объявило, что они останутся действительными: комиссия нашла метод, описанный в работе Клеппе, слишком «неопределенным и сомнительным».
К тому же там не упоминалась возможность экспоненциальной репликации — отличительной черты ПЦР. В суде представители DuPont так и не смогли доказать вторичность изобретения Мюллиса. С этой сделки Cetus выплатила Кэри Мюллису неоправданно малую сумму, фактически ограбив его.
Принцип метода Все мы знаем, что ДНК — это двухцепочечная молекула, где каждая цепочка состоит из звеньев-нуклеотидов. Нуклеотиды составлены из трех молекул: остатка фосфорной кислоты, сахара и азотистого основания. Если сахар и фосфат одинаковы у всех нуклеотидов в ДНК в РНК сахар другой , то азотистых оснований четыре если не считать редкие модификации : аденин, тимин, цитозин и гуанин, обозначаемые А, Т, Ц и Г соответственно.
В молекулах РНК тимин заменен урацилом. Нуклеотиды соединяются в цепочку, образуя связи между фосфатной группой одного нуклеотида и гидроксильной — другого. Чтобы молекула была стабильной, цепочки должны как-то взаимодействовать друг с другом.
Это обеспечивают водородные связи , образующиеся между азотистыми основаниями противоположных цепей по принципу комплементарности : А соединяется только с Т или У в РНК , а Г — с Ц рис. И поэтому, имея одну цепь ДНК, в соответствии с этим правилом легко построить ее пару. Собственно, на этом и основана ПЦР.
Рисунок 5. Строение ДНК. Видео 2.
Типичная реакционная смесь Анализируемая ДНК. Это может быть как отдельный кусочек молекулы, так и плазмида, хромосома или геном клетки полностью. Для грубой оценки сойдет даже суспензия клеток.
ДНК служит матрицей для многократного копирования нужного участка. Праймер — это искусственно синтезированная короткая цепочка нуклеотидов 15—30 штук , комплементарная выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи.
Фермент, строящий комплементарную матричной цепь ДНК. Обычно используют термостабильные полимеразы, изначально выделенные из термофильных бактерий и архей: Thermus aquaticus Taq-полимераза , Pyrococcus furiosus Pfu-полимераза и Pyrococcus woesei Pwo-полимераза. Первая — самая производительная, а две другие — более точные.
Раствор, содержащий различные ионы для поддержания нужного рН, соли магния, необходимые для работы полимеразы, и неионный детергент Tween-20 в сочетании с BSA бычьим сывороточным альбумином для предотвращения налипания компонентов реакции на стенки пробирки. В случае ГЦ-богатых матриц в смесь часто добавляют энхансер — ДМСО диметилсульфоксид , предотвращающий нежелательные взаимодействия между комплементарными участками матрицы.
Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1—1,5 мл в стерильные пробирки. Биоптаты, то есть материалы, полученные путем биопсии.
Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2—3 мм3. Хранение и транспортировка биоматериала. Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов.
Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов. Выделение ДНК из образца. Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца.
Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором. Проведение ПЦР. Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл.
Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2—3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные, включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные, не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
Регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35—40 минут проводят разделение продуктов амплификации.
После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате. Интерпретация результатов исследования. Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени.
Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций.
Кроме того, можно оценить уровень иммунной защиты организма. Отличие экспресс-тестов от обыкновенных не только в быстром результате, но и в месте проведения. Делаются такие не в специальной лаборатории, а локально. Берется кровь из пальца либо из вены. Это очень удобно, если необходимо протестировать много людей вне медицинского учреждения. Например, летом 2020 года власти Германии решили бесплатно тестировать таким методом иностранных туристов, которые прибывали в аэропорт. Особенно важно провериться на наличие антител IgG и IgM тем категориям населения, которые контактируют со множеством людей и находятся в группе риска. ПЦР тест Этот вид диагностики коронавируса признан лучшим из-за надежности.
Такой тест не только помогает обнаружить носителя инфекции, но и вовремя выявить контактирующих. В 1993 году автор методики полимеразной цепной реакции, Кэри Мюлис, получил Нобелевскую премию по химии. Ее суть в том, что берется фрагмент ДНК в малой концентрации и значительно искусственно увеличивается при помощи ферментов. PCR считается самым чувствительным, потому что определяет наличие возбудителя и его количество, даже когда содержание минимальное. Анализ этим методом особенно актуальный при бессимптомном течении заболевания.
Маркеры гепатита С и расшифровка результатов количественного анализа HCV RNA
| Маркеры гепатита С и расшифровка результатов количественного анализа HCV RNA | ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод обнаружения инфекций. |
| ПЦР на гепатит C: расшифровка количественного и качественного анализа, норма | Маркеры гепатита С. Анализы методом ПЦР и ИФА для выявления в крови вируса гепатита С. |
«Вероятность обнаружить вирус снижается». Когда нужно сдавать ПЦР-тест
Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, используется для диагностики язвы желудка, колита, энтерита. Тест на антитела ИФА (ИХЛА) считается более сложным и более точным, чем ПЦР-тест. ПЦР-тест — основной метод обнаружения коронавирусной инфекции. Полимеразная цепная реакция — что это такое, какие еще заболевания выявляет, в чем преимущества и РИА Новости, 22.01.2024. В больницу пациентов с COVID-19 госпитализируют, как правило, после того, как им сделали ПЦР-тест.
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
ПЦР-тест направлен на определение возбудителя заболевания, а не на реакцию на его проникновение со стороны организма. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР). это методика, позволяющая выявить даже небольшие концентрации возбудителя инфекции.
Контроль взятия материала (КВМ) - что это такое?
Родоначальником метода ПЦР (полимеразной цепной реакции) считается ученый из Норвегии Х. Клеппе. Тест на коронавирус, проводимый через полимеразную цепную реакцию, позволяет определить, болеет обследуемый или нет. Аббревиатура ПЦР обозначает полимеразная цепная реакция. Тесты на ВПЧ могут быть качественными (простой ПЦР) и количественными (Digene test, ПЦР), они предназначены для выявления некоторых типов папилломавирусов. Разобравшись, чем отличается тест ПЦР от антител на КОВИД, удастся облегчить диагностику коронавирусной инфекции, избежать лишних финансовых трат на несвоевременные или недостоверные обследования. Анализ методом ПЦР позволяет обнаружить возбудителя заболевания, присутствующего в организме даже в минимальных количествах.
Что такое ПЦР-анализ?
| Антитела к гепатиту С: что означает их обнаружение в крови | Такая возможность существует при ПЦР-тесте, когда биоматериал получают с помощью соскоба эпителиальных клеток из ротоглотки. |
| Новости Республики Коми | Комиинформ | Анализы при гепатите С с расшифровкой (ПЦР) являются надежным показателем наличия вируса в крови человека. |
| Что такое ПЦР-анализ? | Виды теста методом полимеразной цепной реакции: качественная, количественная и генотипирование. Как правильно сдавать анализ и расшифровка отрицательного результата ПЦР при положительных показателях ИФА. |
| Новости Республики Коми | Комиинформ | В больницу пациентов с COVID-19 госпитализируют, как правило, после того, как им сделали ПЦР-тест. |
| Почему "ошибаются" ПЦР-тесты - эксперт | Что такое ПЦР, как работает метод ПЦР в диагностике, преимущества методики, показания, подготовка к проведению ПЦР-анализа, как проводится ПЦР-анализ, что показывают результата теста. |
ПЦР-тест и тест на антитела к коронавирусу: как разобраться в результатах?
Анализ сдают натощак. Поесть можно максимум за 12 часов до забора крови. Диагностику следует отложить при повышении температуры. Что показывает тест на антитела? Наличие иммуноглобулинов означает, что пациент либо болеет сейчас, либо переболел коронавирусом недавно. Если антитела отсутствуют, он либо не заражался никогда, либо микроорганизм попал в тело совсем недавно. Иммунный ответ формируется до двух недель. Данное исследование не стоит воспринимать как пробу на коронавирус. Если антитела к нему есть, значит, контакт с возбудителем был. Но их отсутствие нельзя однозначно трактовать как избегание вируса.
Наличие антител и прививки Положительный результат описанного исследования еще не гарантирует невозможность повторного заражения. Иммунитет формируется ориентировочно на полгода. Поэтому в регионах, где установлены ограничения, QR-коды выдаются не только привитым, но и переболевшим в течение последних шести месяцев. Однако присутствие иммуноглобулинов не отменяет необходимость вакцинации. Вопреки распространенному мифу, перед прививкой выяснять их количество не нужно. Дополнительная диагностика Перечисленные методы диагностики позволяют установить наличие в организме COVID-19 и иммунный ответ на него. Однако у разных людей заболевание протекает неодинаково: меняется набор симптомов, риски возникновения тех или иных осложнений. Если у выздоровевшего пациента обнаружены антитела в достаточном количестве, это позволяет ему стать донором крови для лечения тяжелых больных. Для этого ему нужно пройти стандартную диагностику во избежание передачи иных вирусов реципиентам.
Коротко обо всех методах диагностики коронавируса Мы рассмотрели возможные методы обнаружения коронавируса в организме, оценки его устойчивости к данному заболеванию. Подчеркнем, что наличие вируса и выявленные антитела к нему — не одно и то же, поэтому и показания к прохождению обследований отличаются. При появлении первых признаков ОРВИ, которую легко перепутать с коронавирусом, лучше сразу выбрать полимеразную цепную реакцию.
Бедняга Муллис и его последователи сначала использовали тупо три водяных бани с разной температурой, вручную перемещая из одной в другую ценные пробирки с реакцией. Мы на практике в универе почему-то делали так же... Но как только мир понял, что ПЦР - это офигенно, сразу появились лабораторные приборы, которые этот процесс автоматизируют. Фактически это просто нагревательный блок, способный очень точно держать температуру в течение заданного времени и быстро его менять. Сейчас их на рынке пруд пруди, на любой вкус и цвет, чуть ли не кофе умеют готовить. Но как нам это все помогает при анализах на вирус?
Вот такой милаха прогонит ПЦР за полчасика Медицинское применение. Причем ее может быть изначально очень мало, но цепной характер реакции позволит нам ее приумножить. Но если изначально целевой ДНК в пробе нет, то и реакция не пройдет. Добавляем полимеразу и праймеры, которые сядут именно и только на определенное место в ДНК какого-то интересующего нас патогена ДНК патогена ведь сильно отличается от нашей. Запускаем реакцию и смотрим, прошла она или нет! Если прошла - значит, пациент был заражен этим патогеном, а на нет и суда нет. Получился очень точный, быстрый и относительно дешевый метод выявления патогенов - прикиньте, раньше пока анализ на какую-нибудь бактерию высеешь на питательную среду, дождешься, чтобы оно подросло, определишь, что выросло - несколько дней пройдет. А тут готовый результат за пару часов! Осталось только подобрать такие праймеры, чтобы они садились "отжигались" действительно только на ДНК патогена, а не на человеческую ДНК.
Этот трудоемкий процесс и называется созданием тест-системы - наверняка слышали такое словосочетание в новостях! Этим занимаются, как правило, крупные компании, вкладывающие в этот процесс большие деньги и время. Но тут что хорошо - один раз подобрал такие праймеры - и все, дальше любой лаборант с минимальным опытом сможет провести сам анализ. Дальнейшее развитие ПЦР пошло по пути ответа на вопрос "прошла реакция или нет? Логичным ответом на него стала ПЦР в реальном времени англ.
Для анализа требуется специальный аппарат, который определяет количество антител в сыворотке крови в кровяном сгустке. Анализ на ПЦР назначают беременным так как вирус гепатита способен проникать через плацентарный барьер и заражать ребенка и людям, которые контактировали с инфицированными больными. Анализ делается двумя методиками. Качественный показывает, присутствуют ли антитела в русле крови.
То есть качественный анализ выясняет, нужно ли лечение для конкретного больного. Количественный анализ проводится в случае обнаружения маркеров в крови. Специальный аппарат подсчитывает точное количество клеток вируса гепатита. Этот анализ позволяет отслеживать динамику терапии, насколько оно эффективно и не требует ли коррекции. Единственный минус этого анализа: аппарат не способен посчитать количество вируса гепатита, если в крови его практически нет. В крови циркулируют антитела или незначительное количество возбудителя. Такое возможно, если пациент проходит лечение и курс подходит к концу. Если анализ переделать через 4-6 недель после окончания лечения — результат может оказаться совершенно иным. Поверхностный австралийский антиген и маркеры к нему HBsAg — чужеродный белок, образующий внешнюю оболочку вируса гепатита Б.
Антиген помогает вирусу цепляться за печеночные клетки гепатоциты , проникать в их внутреннее пространство. Благодаря ему вирус успешно развивается и размножается. Оболочка поддерживает жизнеспособность вредоносного микроорганизма, дает ему возможность продолжительное время находиться в человеческом организме. Белковая оболочка наделена невероятной устойчивостью к различным негативным воздействиям. Австралийский антиген выдерживает кипячение, не погибает при замораживании. Белок не утрачивает свойств, попав в щелочную или кислую среду. Он не разрушается от воздействия агрессивных антисептиков фенола и формалина. Выделение антигена HBsAg происходит в период обострения. Максимальной концентрации он достигает к концу инкубационного периода примерно за 14 дней до его завершения.
В крови HBsAg сохраняется на протяжении 1-6 месяцев. Затем численность патогена начинает сокращаться, и через 3 месяца его количество приравнивается к нулю. Когда при профилактическом обследовании у здорового пациента обнаруживают антиген HBsAg, сразу не делают вывод о том, что он инфицирован. Сначала подтверждают анализ, проведя другие исследования на присутствие опасной инфекции. Людей, у которых антиген обнаружен в крови спустя 3 месяца, относят к группе вирусоносителей. Часть из них будет заразна до конца жизни. Медики предполагают, что австралийский антиген, пребывая в организме продолжительное время, провоцирует возникновение раковых опухолей. Если при исследовании крови получают положительный результат, это означает, что человек инфицирован. Суммарные антитела к поверхностному антигену вируса находят у пациента при начавшемся выздоровлении.
Происходит это после удаления HBsAg, обычно по прошествии 3-4 месяцев. Anti-HBs защищают человека от гепатита B. Они прикрепляются к вирусу, не позволяя ему разноситься по организму. Благодаря им иммунные клетки быстро вычисляют и убивают патогенных микроорганизмов, не дают прогрессировать инфекции. Суммарная концентрация, появляющаяся после инфицирования, используется для выявления иммунитета после прививки. Нормальные показатели говорят о том, что целесообразно проводить повторную вакцинацию человека. Со временем суммарная концентрация маркеров этого вида понижается. Впрочем, встречаются здоровые люди, у которых антитела к вирусу существуют пожизненно. Возникновение Anti-HBs у больного когда количество антигена устремляется к нулю считают положительной динамикой заболевания.
Пациент начинает выздоравливать, у него появляется постинфекционный иммунитет к гепатиту. Ситуация, когда при остром течении инфекции обнаружены маркеры и антигены, свидетельствует о неблагоприятном развитии болезни. В этом случае патология прогрессирует и усугубляется. Когда делают тесты на Anti-HBs Определение антител проводят: при контролировании хронического гепатита В тесты делают 1 раз в 6 месяцев ; у людей, причисленных к группе риска; перед прививкой; Нормальным считается отрицательный результат. Положительным он бывает: при наметившемся выздоровлении пациента; если возникла вероятность инфицирования другим типом гепатита. Вирусный гепатит С содержит рибонуклеиновую кислоту, а частое наличие ложно положительных результатов при проведении анти-HCV-анализа крови делает его идеальным кандидатом для проведения данного исследования. Это хорошая идея обсудить ваши проблемы с медицинским работником или консультантом, который обучен, чтобы помочь вам справиться с гепатитом и другими. Если это произойдет, стоит поговорить с вашим врачом, поскольку многие консультанты готовы писать в ипотечную или страховую компанию с указанием вашего здоровья и ожидаемой продолжительности жизни. Кто должен сказать: это часто бывает трудным решением, но считайте, что положительный результат может повлиять на вашу семью и сексуального партнера, и должны ли эти люди также думать о тестировании.
Sybr Green I [en] обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью.
Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. Вторая полимераза необходима для коррекции ошибок, внесённых первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК, если был добавлен некомплементарный нуклеотид. Этот некомплементарный нуклеотид удаляет Pfu-полимераза.
Смесь полимераз берётся в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимеразы берётся в 25—100 раз больше, чем Pfu-полимеразы. RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA [en] , ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера около 10 п. Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов.
Подбирая условия длину праймера, его состав, температуру и пр.
HCV, РНК количественно [реал-тайм ПЦР]
Роспотребнадзор напоминает о ключевых особенностях тестирования методом ПЦР и отвечает на самые часто задаваемые вопросы. Отличие иммуноферментного анализа (ИФА) от полимеразной цепной реакции (ПЦР) в том, что ПЦР относится к прямым методам выявления возбудителя инфекции, то есть позволяет определить РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале человека. Анализы при гепатите С с расшифровкой (ПЦР) являются надежным показателем наличия вируса в крови человека. ПЦР-анализ, в отличие от теста на выявление антител, должен определить, присутствует ли вирус в организме прямо сейчас, или пациент перенес инфекцию в прошлом.